Особенности и принципы выделения чистых культур бактерий. Работы Р.Коха и их значение для микробиологии и инфекционной патологии Метод пластинчатых разводок коха
8. Методы выделения чистых культур микроорганизмов
Культивирование микроорганизмов, помимо состава питательной среды, сильно зависит от физических и химических факторов (температура, кислотность, аэрация, свет и т. д.). При этом количественные показатели каждого из них неодинаковы и определяются особенностями метаболизма каждой группы бактерий. Существуют методы культивирования микроорганизмов на твердых и в жидких питательных средах в аэробных, анаэробных и других условиях.
Методы выделения чистых культур аэробных микроорганизмов. Для того, чтобы получить изолированные колонии, при нанесении материал распределяют так, чтобы клетки бактерий были удалены друг от друга. Для получения чистой культуры используют две основные группы методов:
а) методы, основанные на принципе механического разделения микроорганизмов;
б) методы, основанные на биологических свойствах микроорганизмов.
Методы, основанные на принципе механического разделения микроорганизмов
Рассев шпателем по Дригальскому . Берут 3 чашки Петри с питательной средой. На 1-ю чашку петлей или пипеткой наносят каплю исследуемого материала и растирают шпателем по всей поверхности питательного агара. Затем шпатель переносят во 2-ю чашку и втирают оставшуюся на шпателе культуру в поверхность питательной среды. Далее шпатель переносят в 3-ю чашку и аналогичным образом производят посев. На 1-й чашке вырастает максимальное количество колоний, на 3-й - минимальное. В зависимости от содержания микробных клеток в исследуемом материале на одной из чашек вырастают отдельные колонии, пригодные для выделения чистой культуры микроорганизма.
Метод Пастера (метод разведений). Из исследуемого материала готовят ряд последовательных, чаще десятикратных серийных разведений в жидкой стерильной среде или физиологическом растворе в пробирках. Далее высевают материал газоном по 1 мл из каждой пробирки. Предполагают, что в какой-то из пробирок останется количество микроорганизмов, поддающихся подсчету при высеве на пластинчатые среды. Этот метод дает возможность подсчитать микробное число в исследуемом материале. (Микробное число - количество колоний на последней чашке с ростом микроорганизмов, умноженное на степень разведения материала).
Получение чистой культуры методом рассева в глубине среды Метод Коха (метод заливок). Исследуемый материал в небольшом количестве вносят в пробирку с расплавленным и охлажденным до 45-50°С МПА, перемешивают, затем каплю питательной среды с разведенным материалом переносят во вторую пробирку с расплавленным МПА и т.д. Количество разведений зависит от предполагаемой численности микроорганизмов в исследуемом материале. Приготовленные разведения микробов выливают из пробирок в стерильные чашки Петри, обозначенные номерами, соответствующими номерам пробирок. После застудневания среды с исследуемым материалом чашки помещают в термостат. Количество колоний в чашках с питательной средой уменьшается по мере разведения материала.
Рассев петлей (посев штрихами). Берут одну чашку Петри с питательным агаром и делят ее на 4 сектора, проводя разграничительные линии на внешней стороне дна чашки. Исследуемый материал петлей вносят в первый сектор и проводят ею параллельные линии по всему сектору на расстоянии одна от другой около 5 мм. Этой же петлей, не изменяя ее положения по отношению к агару, проводят такие же линии на других секторах чашки. В том месте, где на агар попало большое количество микробных клеток, рост микроорганизмов будет в виде сплошного штриха. На секторах с небольшим количеством клеток вырастают отдельные колонии. Кроме того, можно наливать разведенные растворы смешанной культуры на поверхность твердых сред в чашках.
Метод фильтрации. Основан на пропускании исследуемого материала через специальные фильтры с определенным диаметром пор и разделении содержащихся микроорганизмов по величине. Этот метод применяется главным образом для очистки вирусов от бактерий, а также при получении фагов и токсинов (в фильтрате - чистый фаг, очищенный токсин).
Методы, основанные на биологических свойствах микроорганизмов
Создание оптимальных условий для размножения
Создание оптимального температурного режима для избирательного подавления размножения сопутствующей микрофлоры при низкой температуре и получения культур психрофильных или термофильных бактерий. Большинство микробов неплохо развиваются при 35-37°С, иерсинии хорошо растут при 22°С, лептоспиры культивируют при 30°С. Термофильные бактерии растут при температурах, лежащих за пределами температурных режимов прочих сопутствующих видов бактерий (так, кампилобактер культивируют при 42°С).
Создание условий для аэробиоза или анаэробиоза. Большинство микроорганизмов хорошо растут в присутствии атмосферного кислорода. Облигатные анаэробы растут в условиях, исключающих присутствие атмосферного кислорода (возбудители столбняка, ботулизма, бифидумбактерии, бактероиды и др.). Микроаэрофильные микроорганизмы растут только при низком содержании кислорода и повышенном содержании СО 2 (кампилобактер, геликобактер).
Метод обогащения. Исследуемый материал засевают на элективные питательные среды, способствующие росту определенного вида микроорганизмов.
Метод Шукевича. Исследуемый материал засевают в конденсационную воду скошенного агара. При размножении подвижные формы микробов из конденсационной воды распространяются по агару, как бы «вползают» на его поверхность. Отсевая верхние края культуры в конденсационную воду свежескошенного агара и повторяя это несколько раз, можно получить чистую культуру. Так, для выделения культуры Proteus vulgaris, Clostridium tetani материал засевают в конденсационную воду на дне пробирки со скошенной плотной средой, не касаясь поверхности среды. Названные микроорганизмы способны давать ползучий рост (роение) на поверхности среды. Сопутствующие микробы растут в нижней части питательной среды, а протей и столбнячный микроб в виде пленки распространяются вверх и занимают всю скошенную часть агара.
Метод прогревания. Позволяет отделить спорообразующие бациллы от неспоровых форм. Прогревают исследуемый материал на водяной бане при 80°С 10-15 мин. При этом погибают вегетативные формы, а споры сохраняются и при посеве на соответствующую питательную среду прорастают.
Бактериостатический метод (метод ингибирования). Основан на различном действии некоторых химических веществ и антибиотиков на микроорганизмы. Определенные вещества угнетают рост одних микроорганизмов и не оказывают влияния на другие. Например, небольшие концентрации пенициллина задерживают рост грамположительных микроорганизмов и не влияют на грамотрицательные. Смесь пенициллина и стрептомицина позволяет освободить нитчатые грибы и дрожжи от бактериальной флоры. Серная кислота (5% раствор) быстро убивает большинство микроорганизмов, а туберкулезная палочка выживает в этих условиях. Необходимо учитывать, что селективные факторы часто включены в состав среды в бактериостатических концентрациях, поэтому сопутствующие микрооорганизмы остаются жизнеспособными и при переносе колоний исследуемой культуры на обычные среды могут быть причиной получения смешанной культуры.
Если на основании определенных симптомов на растениях и по результатам микроскопического исследования возникло предположение, что возбудителем болезни является бактерия, следующим шагом должно быть ее выделение.
При этом исходят из того, что возбудитель загрязнен сопутствующими организмами, т. е. налицо смешанная популяция. Чтобы получить возбудителя в виде отдельной растущей колонии, мацерат ткани следует посеять на среду штрихом.
Посев штрихом . Прокаленной инокуляционной петлей берут небольшое количество содержащего бактерии мацерата растительной ткани и легкими движениями, не повреждая поверхности агара, наносят на подготовленную питательную среду 4-6 штрихами. Повторно прокалив петлю, чашку со средой поворачивают на 90° вправо и затем от второго штриха наносят еще 4-6 штрихов, вновь прокаливают иглу и проводят третий посев. Этим достигается такое разведение исходного материала, при котором бактерии после инкубации в термостате в течение 48-72 ч при 28 °С формируют отдельные колонии различной формы и окраски. Затем колонии переносят для дальнейшего исследования в пробирки с косым агаром. Прокаленной петлей берут колонию и осторожным движением в виде змейки или зигзага наносят на питательный агар.
Метод разлива в чашки по Коху . Метод разлива в чашки по Коху обеспечивает формирование каждой колонии из одной единственной бактериальной клетки. Лучше всего приготовить из исходного материала суспензию в стерильной воде и применять метод Коха только с этим разведением. Небольшое количество суспензии переносят в первую пробирку с питательной средой, охлажденной до 60 °С. Затем содержимое пробирки перемешивают с инокулюмом, вращая ее между ладонями. Далее, берут вторую пробирку, осторожно открывают над пламенем горелки и большими петлями переносят в нее из первой пробирки три порции субстрата. Содержимое пробирки после обжига горлышка и пробки выливают в первую чашку Петри, приоткрывая крышку чашки ровно настолько, чтобы ввести под нее горлышко пробирки. Сразу после выливания чашку закрывают и осторожными движениями равномерно распределяют питательную среду.
Тщательно перемешав содержимое второй пробирки, берут третью пробирку и петлей переносят в нее из второй шесть порций субстрата. Содержимое пробирки выливают в чашку, а содержимое пробирки после перемешивания - в чашку. Чашки со средой инкубируют в термостате при 28°С, через несколько дней содержавшиеся в исходном материале бактерии формируют колонии.
Последовательное разведение . Если, например, необходимо изолировать бактерии из почвы, то используют последовательное разведение. Стерильную питательную среду (15 мл на чашку) разливают по чашкам, на затвердевший агар наносят по 0,1 мл последних трех разведений суспензии и стеклянным шпателем распределяют по поверхности.
Для выделения бактерий 1 г почвы суспендируют в 9 мл воды, хорошо взбалтывают, дают несколько секунд отстояться и из суспензии готовят последовательные разведения. С помощью этого метода можно определить число микроорганизмов в каждой пробе.
Если вы нашли ошибку, пожалуйста, выделите фрагмент текста и нажмите Ctrl+Enter .
В отличие от подсчета клеток под микроскопом, этот метод дает возмож-
ность определить только число жизнеспособных клеток в популяции. Поскольку сред, одинаково пригодных для роста различных микроорганизмов, не существует, метод высева дает возможность определить число клеток микроорганизмов, способных расти на среде данного состава, но не позволяет учесть те микроорганизмы, которые не растутут или растут крайне медленно.
Метод широко применяется для опредления численности жизнеспособных клеток в различных естественных субстратах и в лабораторных питательных средах. Сущность его заключается в высеве определенного объема исследуемой суспензии микроорганизмов на плотную среду в чашки Петри и подсчете выросших после инкубации колоний. Принято считать, что каждая колония - потомство одной клетки.
Работа этим методом включает три этапа: приготовление разведений, посев на плотную среду в чашки Петри и подсчет выросших колоний.
Приготовление разведений . Численность популяции микроорганизмов обычно достаточно велика, поэтому для получения изолированных колоний необходимо приготовить ряд последовательных разведений. Разведения готовят в водопроводной воде или 0,85%-ном растворе NaCl, используя постоянный коэффициент разведения, чаще всего равный 10. В ходе опыта целесообразно использовать один и тот жеикоэффициент разведения, так как это уменьшает вероятность ошибки. Для приготовления разведений стерильную водопроводную воду разливают по 9 мл в стерильные сухие пробирки. Затем 1 мл иссле-дуемой суспензии стерильной пипеткой переносят в пробирку с 9 мл стерильной воды - это 1-е разведение,10 -1 . Полученное разведение тщательно перемешивают новой стерильной пипеткой, вбирая в пипетку и выпуская из нее полученную взвесь. Эту процедуру выполняют 3-5 раз, затем этой же пипеткой отбирают 1 мл полученной суспензии и переносят во 2-ю пробирку - получают 2-е разведение, 10 -2 . Таким же образом готовят и последующие разведения. Степень разведения зависит от плотности исследуемой популяции микроорганизмов; соответственно она тем больше, чем больше плотность популяции.
Для приготовления каждого разведения следует обязательно использовать новую пипетку. Пренебрежение этим правилом приводит к получению ошибочного результата.
Проведение посева . Высевать суспензию можно поверхностным или глубинным способом.
Перед посевом поверхностным способом (рис. 16) разливают расплавлен-ную, чаще всего агаризованную, питательную среду в ряд стерильных чашек Петри по 15-20 мл в каждую. Чашки оставляют на горизонтальной поверх-ности, поеа среда не застынет. Поверхность агаризованных сред перед посевом рекомендуется подсушивать для удаления конденсационной воды. С этой целью чашки Петри открывают и застывшей средой вниз помещают на 20-30 мин в сушильный шкаф, нагретый до 70-80 0 С. Предварительно шкаф необходимо простерилизовать.
Рисунок 16. Схема приготовления разведений и рассева суспензии микроорганизмов шпателем.
Агаризованную среду можно подсушить, поместив чашки в термостат на 2-3 суток крышками вниз. После того как среда готова, на ее поверхность стерильной пипеткой наносят точно измеренный объем (0,05 или 0,1 мл) соответствующего разведения и распределяют его стерильным стеклянным шпателем по поверхности среды. Высевы на плотную среду проводят, как правило, из трех последних разведений, причем из каждого делают 2-4 параллельных высева. Посевы можно делать одной пипеткой, но при этом начинать следует обязательно с большего разведения. Для каждого разведения используют новый стерильный шпатель. После посева чашки Петри помещают в термостат крышками вниз.
При глубинном посеве (рис. 17) точно измеренный объем (как правило, 0,1, 0,5 или 1 мл) суспензии или разведения вносят в расплавленную и остуженную до 48-50° агаризованную среду, тщательно перемешивают и затем немедленно выливают в чашку Петри. Среде дают застыть. В случае глубинного посева обычно пользуются средой, разлитой в пробирки. При больших масштабах работы среду по пробиркам не разливают, а поступают следующим образом. По
Рисунок 17. Схема приготовления разведений и посева суспензии микроорганизмов глубинным способом
1 мл из соответствующего разведения переносят стерильной пипеткой в 2-4 стерильные чашки Петри. Затем заливают чашки 15-20 мл расплавленной и остуженной до 48-50° плотной средой и тщательно смешивают питательную среду с посевным материалом легким вращательным движением чашки по поверхности стола, после чего чашки оставляют на горизонтальной поверхности до застывания. Когда среда застынет чашки Петри помещают в термостат.
Для определения количества клеток анаэробных микроорганизмов чашки Петри с плотной средой после посева помещают в анаэростаты.
Подсчет выросших колоний . Колонии бактерий подсчитывают обычно через 3, колонии грибов и дрожжей - через 5-7, а колонии актиномицетов - через 7-15 суток инкубации в термостате.
Подсчет, как правило, проводят, не открывая чашек Петри. Для удобства чернилами или карандашом по стеклу отмечают просчитанную колонию точкой на наружной стороне дна чашки. При большом количестве колоний дно чашки Петри делят на секторы, подсчитывают число колоний в каждом секторе и результаты суммируют. Существуют специальные счётчики для подсчёта колоний (рис.18). Для подсчёта колоний чашкуПетри крышкой вниз помещают на стерильный столик (1), подсвечиваемый снизу, и подсчитывают колонии пером с пружинным острием (2). Остриём пера касаются дна чашки в участке, соответствующем положению колоний, и нажимают на перо. В результате на стекле остается метка, а держатель поднимается вверх, замыкая цепь, и показания счётчика увеличиваются на единицу. Затем острие пера поднимают над стеклом, пружина возвращает его в исходное положение, и цепь размыкается.
Рисунок18. Счетчик для подсчета числа колоний микроорганизмов
Лучшим разведением следует считать то, при высеве из которого на агаровой пластинке в чашке Петри вырастает от 30-50 до 100- 150 колоний. Если число выросших колоний оказалось меньше 10, то эти результаты для расчета количества клеток в исходном материале не используют. Результаты параллельных высевов из одного и того же разведения суммируют и определяют среднее число колоний, выросших при высеве из данного разведения на одной чашке.
Количество клеток в 1 мл исследуемого субстрата вычисляют по
формуле: М= а 10 n ,
где М - количество клеток в 1 мл, а - среднее число колоний при высеве данного разведения, 10-коэффициент разведения, п - порядковый номер разведения, из которого сделан высев, V -объем суспензии, взятый для посева, в мл.
Метод Коха используется для определения общего количества бактерий. В пустую стерильную чашку Петри наливают 1 мл исследуемого материала из соответствующего разведения и заливают 10 - 15 мл расплавленного и остуженного до 45 0 С МПА, смешивают с жидкостью, вращая чашку на поверхности стола.
После культивирования посевов производится подсчет колоний, выросших на поверхности и в глубине агара. Для этого чашку кладут вверх дном на черный фон, каждую сосчитанную колонию отмечают маркером по стеклу. Оценивают только те чашки, на которых выросло от 30 до 300 колоний. Если на чашке выросло более 300 колоний, а анализ нельзя повторить, то допускается подсчет колоний при сильном боковом освещении при помощи лупы и специальной пластинки с сеткой.
Подсчитывается количество колоний не менее чем в 20 квадратах площадью 1 см 2 в разных местах чашки. Рассчитывается среднее количество колоний в 1 см 2 , которое умножается на площадь чашки.
При подсчете колоний может быть использован специальный прибор счета бактерий – ПСБ.
Результат подсчета колоний в каждой чашке - количество бактерий на 1 мл (см 3) или 1 г исследуемого материала с учетом разведения. За окончательное количество бактерий принимают среднеарифметическое результатов подсчета колоний на чашках с посевом двух соседних разведений.
Пример: разведение 10 -1 - 250 колоний, разведение 10 -2 - 23 колонии.
Общее количество бактерий = 250 х 10 + 23 х 100 / 2 =2400 кое/мл = 2,4 х 10 2 кое/мл (колониеобразующих единиц на 1 мл).
Результат исследований может быть округлен до 2 - 3 значащих цифр.
Титрационный метод.
Используется для определения количества СПМ.
1-ый этап: гомогенизация материала. При необходимости приготовление суспензии с целью перевода микроорганизмов в жидкую фазу.
2-ой этап: приготовление серии разведений.
3-ий этап: посев избранных объемов исследуемого материала (100, 10, 1 мл) и его разведений по 1 мл в жидкую питательную среду. Для повышения точности метода каждый объем может параллельно засеваться в несколько порций питательной среды (двух-, трех-, пятирядный посев). Оптимальным является трехкратное повторение (достаточная достоверность при сравнительно небольшой стоимости).
4-ый этап: учет наличия роста на жидкой питательной среде и высев из положительных объемов на плотную питательную среду.
5-ый этап: идентификация микроорганизмов, выросших на плотной питательной среде. При этом учитываются культуральные свойства и при необходимости проводятся дополнительные исследования (изучение тинкториальных, морфологических, биохимических и серологических свойств).
Если использован однорядный метод, как правило, результат выражается в виде титра искомого микроорганизма, за который принимается наименьший объем (наибольшее разведение), в котором еще он был обнаружен.
Если был использован многорядный метод, учет результатов проводится с помощью специальных таблиц, позволяющих по комбинации положительных объемов, давших рост, определить титр, индекс (НВЧ).
Культивирование микроорганизмов, помимо состава питательной сре-ды, зависит от физических и химических факторов (температура, кислотность, аэрация, свет и т. д.). При этом количественные показатели каждого из них неодинаковы и определяются особенностями метаболиз-ма каждой группы бактерий. Существуют методы культивирования мик-роорганизмов на твердых и в жидких питательных средах в аэробных, анаэробных и других условиях.
Методы выделения чистых культур аэробных микроорганизмов. Для того, чтобы получить изолированные колонии, при нанесении материал распределяют так, чтобы клетки бактерий были удалены друг от друга. Для получения чистой культуры используют две основные группы методов:
а) мето-ды, основанные на принципе механического разделения микроорганизмов;
б) методы, основанные на биологиче-ских свойствах микроорганизмов.
Методы, основанные на принципе механического разде-ления микроорганизмов
Рассев шпателем по Дригальскому . Берут 3 чашки Петри с питательной средой. На 1-ю чашку петлей или пипеткой наносят кап-лю исследуемого материала и растирают шпателем по всей поверхности питательного агара. Затем шпатель пе-реносят во 2-ю чашку и втирают оставшуюся на шпателе культуру в поверхность питательной среды. Далее шпа-тель переносят в 3-ю чашку и аналогичным образом про-изводят посев. На 1-й чашке вырастает максимальное количество колоний, на 3-й - минимальное. В зависимо-сти от содержания микробных клеток в исследуемом ма-териале на одной из чашек вырастают отдельные коло-нии, пригодные для выделения чистой культуры микро-организма.
Метод Пастера (метод разведений). Из исследуемого материала готовят ряд последовательных, чаще десятикратных серийных разведений в жидкой стерильной среде или физиологическом растворе в пробирках. Далее высевают материал газоном по 0,5 мл из каждой пробирки. Предполагают, что в какой-то из пробирок останется количество микроорганизмов, поддающихся подсчету при высеве на пластинчатые среды. Этот метод дает возможность подсчитать микробное число в исследуемом материале. (Микробное число — количество колоний на последней чашке с ростом микроорганизмов, умноженное на степень разведения материала).
Рассев петлей (посев штрихами). Берут одну чашку Петри с питательным агаром и делят ее на 4 сектора, проводя разграничительные линии на внешней стороне дна чашки. Исследуемый ма-териал петлей вносят в первый сектор и проводят ею па-раллельные линии по всему сектору на расстоянии одна от другой около 5 мм. Этой же петлей, не изменяя ее положения по отношению к агару, проводят такие же линии на других секторах чашки. В том месте, где на агар попало большое количество микробных клеток, рост микроорганизмов будет в виде сплошного штриха. На секторах с небольшим количеством клеток вырастают отдельные колонии. Кроме того, можно наливать разведен-ные растворы смешанной культуры на поверхность твер-дых сред в чашках.
Метод фильтрации. Основан на пропускании исследуемого материала через специальные фильтры с определенным диаметром пор и разделении содержа-щихся микроорганизмов по величине. Этот метод при-меняется главным образом для очистки вирусов от бак-терий, а также при получении фагов и токсинов (в фильтрате — чистый фаг, очищенный токсин).
Методы, основанные на биологических свойствах мик-роорганизмов
Создание оптимальных условий для размножения
- Создание оптимального температурного режима для избирательного подавления размножения сопутствующей микрофлоры при низкой температуре и получения культур психрофильных или термофильных бактерий. Большинство микробов неплохо развиваются при 35-37°С, иерсинии хорошо растут при 22°С, лептоспиры культивируют при 30°С. Термофильные бактерии растут при температурах, лежащих за пределами температурных режимов прочих сопутствующих видов бактерий (так, кампилобактер культивируют при 42°С).
- Создание условий для аэробиоза или анаэробиоза. Большинство микроорганизмов хорошо растут в присутствии атмосферного кислорода. Облигатные анаэробы растут в условиях, исключающих присутствие атмосферного кислорода (возбудители столбняка, ботулизма, бифидумбактерии, бактероиды и др.). Микроаэрофильные микроорганизмы растут только при низком содержании кислорода и повышенном содержании СО2 (кампилобактер, геликобактер).
- Метод обогащения. Исследуемый материал за-севают на элективные питательные среды, способствую-щие росту определенного вида микроорганизмов.
Методы выделения чистых культур микроорганизмов
Метод Пастера (метод предельных разведений). Заключается в том, что из исследуемого материала делают ряд последовательных разведений в жидкой питательной среде. Для этого каплю посевного материала вносят в пробирку со стерильной жидкой средой, из нее каплю переносят в следующую пробирку и так засевают до 8…10 пробирок. С каждым разведением количество микробных клеток, попадающих в среду, будет уменьшаться и можно получить такое разведение, в котором во всей пробирке со средой будет находиться только одна микробная клетка, из которой разовьется чистая культура микроорганизма.
Так как в жидких средах микробы растут диффузно, т.е. легко распределяются во всей среде, то изолировать одну микробную клетку от другой трудно. Таким образом, метод Пастера не всегда обеспечивает получение чистой культуры. Поэтому в настоящее время этот метод используется, главным образом, для предварительного уменьшения концентрации микроорганизмов в материале перед посевом его в плотную среду для получения изолированных колоний.
Методы механического разделения микроорганизмов с использованием плотных питательных сред. К таким методам относятся метод Коха и метод Дригальского.
Метод Коха (метод глубинного посева).
Исследуемый материал вносят бактериологической петлей или пастеровской пипеткой в пробирку с расплавленной плотной питательной средой. Равномерно размешивают содержимое пробирки, вращая ее между ладонями. Каплю разведенного материала переносят во вторую пробирку, из второй – в третью и т.д. Содержимое каждой пробирки, начиная с первой, выливают в стерильные чашки Петри. После застывания среды в чашках, их помещают в термостат для культивирования.
Для выделения анаэробных микроорганизмов по методу Коха необходимо ограничить доступ кислорода к культуре.
С этой целью поверхность глубинного посева в чашке Петри заливают стерильной смесью парафина и вазелина (1:1). Можно также оставлять посевной материал, тщательно перемешанный с агаризованной средой, непосредственно в пробирке.
Ватную пробку при этом заменяют резиновой или заливают поверхность агара смесью парафина и вазелинового масла. Чтобы извлечь выросшие колонии анаэробных микроорганизмов, пробирки слегка нагревают, быстро вращая над пламенем горелки. Агар, прилегающий к стенкам, расплавляется, и столбик легко выскальзывает в подготовленную чашку Петри. Далее столбик с агаром разрезают стерильным скальпелем, колонии извлекают стерильной петлей или стерильной капиллярной рубкой и переносят в жидкую среду.
Метод Дригальского основан на механическом разделении микробных клеток на поверхности плотной питательной среды в чашках Петри.
Каждая микробная клетка, фиксируясь в определенном месте, начинает размножаться, образуя колонию.
Для посева по методу Дригальского используют несколько чашек Петри, залитых плотной питательной средой.
На поверхность среды вносят каплю исследуемого материала.
Затем с помощью стерильного шпателя эту каплю распределяют по всей питательной среде (посев газоном).
Посев также можно проводить штрихом, используя бактериологическую петлю. Этим же шпателем или петлей осуществляют посев во вторую, третью и т.д. чашки. Как правило, в первой чашке после культивирования посева появляется рост микробов в виде сплошного налета, в последующих чашках содержание микроорганизмов снижается и образуются изолированные колонии, из которых отсевом можно легко выделить чистую культуру.
Таким образом, в первых секторах получается сплошной рост, а вдоль последующих штрихов вырастут обособленные колонии, представляющие собой потомство одной клетки.
В целях экономии сред и посуды можно пользоваться одной чашкой, разделив ее на сектора, и последовательно засевать их штрихом (метод истощающего штриха).
Для этого материал берут петлей и проводят ею ряд параллельных штрихов сначала по поверхности первого сектора, а затем последовательно оставшимися на петле клетками засевают все другие сектора.
При каждом последующем штрихе происходит уменьшение количества засеваемых клеток.
Метод выделения чистых культур с помощью химических веществ используется при изолировании культур микроорганизмов, устойчивых к определенным химическим веществам.
Например, с помощью этого метода можно выделить чистую культуру туберкулезных микобактерий, устойчивых к действию кислот, щелочей и спирта. В этом случае исследуемый материал перед посевом заливают 15 % раствором кислоты или антиформином и выдерживают в термостате в течение 3…4 часов.
После воздействия кислоты или щелочи клетки туберкулезной палочки остаются живыми, а все другие микроорганизмы, содержащиеся в исследуемом материале, погибают. После нейтрализации кислоты или щелочи обработанный материал высевают на плотную среду и получают изолированные колонии возбудителя туберкулеза.
Биологические методы выделения чистых культур патогенных микроорганизмов основаны на заражении исследуемым материалом лабораторных животных, восприимчивых к данному виду возбудителя.
Если патогенный микроорганизм содержится в исследуемом объекте, то лабораторное животное заболевает и погибает. После вскрытия павшего животного из внутренних органов делают посевы на специальные среды, на которых вырастают чистые культуры выделяемых микробов.
Предыдущая567891011121314151617181920Следующая
ПОСМОТРЕТЬ ЕЩЕ:
Выделение чистой культуры бактерий
Чистой называют культуру, содержащую микроорганизмы одного вида и полученную как потомство одной клетки. Чистые культуры можно получить из исходной микробной клетки, изолиро-ванной при помощи микроманипулятора, или из изолированных колоний путем их пересева в отдельные пробирки с питательной средой.
Для выделения чистой культуры используют следующие методы.
1. Метод Дригалъского. При этом методе расплавленную питательную среду разливают в 3 чашки Петри. В первую чашку вносят одну каплю исследуемого материала и сте-рильным шпателем распределяют его по поверхности питательной среды. Затем шпатель переносят во вторую и далее в третью чашки, втирая в поверхность питательных сред оставшийся на нем материал.
При посеве этим методом на второй и на третьей чашках вырастают изолированные колонии. Полученные отдельные колонии пересевают в пробирки с питательной средой для получения чистой культуры микроорганизма.
2. Метод параллельных штрихов. При этом способе материал с помощью бактериологической петли распределяют по поверхности агара параллельными штрихами в одном направлении.
Затем, повернув чашку на 90°, проводят штрихи в направлении, перпендикулярном первым штрихам. При таком способе посева материал, находящийся в петле, расходу-ется постепенно, и по линиям штрихов, нанесенных в конце посева, вырастают изолированные колонии микробов.
3. Метод Коха (метод рассева в глубине среды). При этом методе в пробирку с агаром, расплавленным и остуженным до 43-45°С, вносят одну бактериологическую петлю исследуемого материала и тщательно перемешивают.
После этого из этой пробирки одну петлю материала переносят во вторую пробирку, а затем из нее – в третью пробирку. Приготовленные разведения бактерий выливают из пробирок в стериль-ные чашки Петри. После застывания среды чашки помещают в термостат. Количество колоний в чашках с питательной средой уменьшается по мере разведения материала.
Контрольные вопросы по теме занятия:
1. Характер роста бактерий в жидких, на полужидких и плотных питательных средах.
Характеристика колоний микроорганизмов.
3. Пигменты бактерий и их роль для микроорганизмов.
4. методы выделения чистых культур бактерий.
Литература для подготовки к занятию:
Основная литература:
1. Медицинская микробиология, вирусология и иммунология. Под ред. А.А.
Воробьева. М., 2004.
Дополнительная литература:
1. Л.Б. Борисов. Медицинская микробиология, вирусология, иммунология. М., 2002.
2. О.К. Поздеев. Медицинская микробиология.
М., ГЭОТАР-МЕДИА, 2005.
3. Медицинская микробиология. Справочник. Под ред. В.И. Покровского и О.К. Поздеева. М., ГЭОТАР-МЕД, 1998.
ЗАНЯТИЕ 5
ТЕМА ЗАНЯТИЯ : Ферменты бактерий. Изучение ферментативной активности микроорганизмов. Дыхание бактерий. Методы культивирования и выделения чистой культуры анаэробов.
УЧЕБНАЯ ЦЕЛЬ ЗАНЯТИЯ : Ознакомиться с ферментами бактерий.
Изучить методы определения ферментативной активности микроорганизмов. Ознакомиться с процессами дыхания бактерий. Изучить методы культивирования и выделения чистой культуры анаэробов.
ЗАДАЧИ ЗАНЯТИЯ :
1. Ознакомиться с ферментами бактерий.
Изучить методы определения ферментативной активности микроорганизмов.
3. Ознакомиться с процессами дыхания бактерий.
4. Изучить методы культивирования и выделения чистой культуры анаэробов.
Ферменты бактерий
Все биохимические процессы в клетке микро-организмов, связанные с метаболизмом, ростом и размножением, совершаются при участии ферментов (энзимов).
Ферменты синтезируются самой микробной клеткой, и имеют сложное строение. Они представляют собой либо только белок с высокой молекулярной массой (трипсин, пепсин и др.), либо состоят из белка (апофермента), связанного с кофактором (коферментом). Кофермент может быть низкомолекулярным неорганическим (металл) или органическим ве-ществом.
Классификация ферментов основана на типах реакций, которые они катализируют.
Все ферменты делятся на шесть классов:
1). Оксидоредуктазы — ферменты переноса электронов. Эти ферменты катализируют окис-лительно-восстановительные реакции. К ним отно-сятся дегидрогеназы (НАД, НАДФ, ФАД), каталаза, цитохромы.
Трансферазы — ферменты переноса групп между молекулами от одних соединений к другим. К ним относятся ацетилтрансфераза, фосфотрансфераза, аминотрансфераза.
3). Гидролазы — ферменты переноса функциональных групп с участием воды. К этому классу ферментов относятся пептидгидролазы, глюкозидаза, амилазы, эстеразы, липаза, фосфатаза.
4). Лиазы — ферменты, отщепляющие или присоединяющие без участия воды различные соединения с двойной связью.
К этим ферментам относятся пируватдекарбоксилаза, альдолаза.
5). Изомеразы — ферменты, переносящие группы внутри молекул с образованием изомерных форм. К этим ферментам относятся триизофосфатизомераза, глюкозофосфатизомераза.
Лигазы (синтетазы) — ферменты, объединяющие две молекулы с одновременным разрывом фосфатных связей с использованием энергии АТФ. К лигазам относятся ферменты, катализирующие синтез сложных органических веществ из простых соединений (аспарагинсинтетаза, кокарбоксилазы).
Активность ферментов измеряют в международных еди-ницах (ME). 1 ME соответствует количеству ферментов, пре-вращающему один микромоль субстрата в 1 минуту в стандарт-ных условиях.
У бактерий различают эндоферменты и экзоферменты.
Эндоферменты находятся внутри бактериальной клетки, катализиру-ют внутриклеточные процессы обмена веществ. Экзоферменты выделяются во вне-шнюю среду и выполняют функцию расщепления сложных питательных веществ.
Ферменты агрессии. У патогенных бактерий имеется особая группа экзоферментов, которые называются ферментами агрессии . Они выполняют функции облегчения проникновения и распространения бактерий в тканях организма хозяина и ослабления его защитных свойств.
К ферментам агрессии относятся: гиалуронидаза, нейраминидаза, коллагеназа, протеазы, фибринолизин, гемолизин, лейкоцидин.
Конститутивные и индуцибельные ферменты. Ферменты, которые синтезируются клеткой с постоянной скоростью, независимо от наличия субстрата в среде называются конститутивными . Индуцибельные (адаптивные) ферменты образуются только в присутствии соответствующего субстрата в сре-де.
Например, фермент бета-галактозидаза начинает синтезироваться только при добавлении в питательную среду углевода лактозы, которую этот фермент расщепляет с образованием глюкозы и галактозы.
Методы определения ферментативной активности микробов
Обязательным условием идентификации выделенной чистой культуры бактерий является определение ферментативной активности в отношении углеводов и белков (биохимический «паспорт» вида).
Для выявления ферментов, расщепляющих углеводы (сахаролитические ферменты) используют дифференциально-диагностические среды Гисса.
В состав сред Гисса входит пептонная вода, индикатор рН, поплавок для улавливания газа и один из углеводов (глюкоза, лактоза, мальтоза, маннит, сахароза, крахмал и т.д.). Если бактерии расщепляют углевод, то образуется кислота и при этом меняется цвет среды за счет находящегося в ней индикатора рН. Большинство патогенных бактерий расщепляют углеводы с образованием только кислоты; некоторые виды ферментируют углеводы с образование кислоты и газа (СО2).
При этом меняется цвет среды и в поплавке появляется пузырек газа.
Протеолитическая активность бактерий. Показателями глубокого расщепления белка является образование индола, аммиака, сероводорода. Для выявления этих газообразных веществ делают посевы чистой культуры бактерий на мясо-пептонный бульон или пептонную воду в пробирки со специальными бумажными индикаторами.
При наличии продуктов расщепления меняется цвет соответствующего индикатора.
Протеолитическую активность бактерий определяют также путем посева чистой культуры уколом в столбик желатина по наличию и характеру разжижения среды, например, в виде перевернутой елочки, гвоздя, воронки и т.д.
Энергетический метаболизм
Это совокупность биохимических реакций, результатом которых является образование (накопление энергии) и расщепление (расход энергии) макроэргических связей в молекулах АТФ.
У бактерий АТФ может синтезироваться в результате процессов брожения и дыхания.
Брожение. Более древний, низкоэффективный способ получения энергии, при котором в результате расщепления молекулы глюкозы образуется 2 молекулы АТФ. Конечными продуктами брожения являются СО2, вода, спирты и органические кислоты.
Процесс происходит без участия кислорода.
Дыханием называют процесс окислительного фосфорилирования углеводов с образованием молекул АТФ, СО2 и воды. При распаде одной молекулы глюкозы высвобождаются 12 электронов, которые проходят через цепь дыхательных ферментов, отдавая энергию для синтеза 36 молекул АТФ. Освобождение дыхательной цепи от электронов осуществляют вещества, называемые акцепторами электронов .
К таким веществам относится кислород, сульфаты, нитраты, карбонаты. Если конечным акцептором электронов служит мо-лекулярный кислород, дыхание называют аэробным . В случае конечной акцепции электронов другими соединениями дыхание называют анаэробным .
По типу дыхания бактерии классифицируют на че-тыре основные группы:
1. Облигатные (строгие) аэробы растут при свободном доступе кислорода (возбудитель ту-беркулеза).
Микроаэрофилы растут при низкой (до 1%) концентрации кислорода и повышенной концентрации углекислого газа (гемофильная палочка).
Факультативные анаэробы могут расти как в присутствии кислорода, так и в анаэробных условиях (кишечная палочка).
4. Облигатные (строгие) анаэробы могут расти только при пол-ном отсутствии кислорода в окружающей среде (возбудители столбняка, ботулизма, газовой гангрены).
Читайте также:
Выделение чистых культур микроорганизмов
Чистой культурой называют такую культуру, которая содержит микроорганизмы одного вида. Выделение чистых культур бактерий – обязательный этап бактериологического исследования в лабораторной диагностике инфекционных болезней, в изучении микробной загрязненности различных объектов окружающей среды, и, в целом, при любой работе с микроорганизмами.
Исследуемый материал (гной, мокрота, фекалии, кровь и другой материал от больных; вода, почва, воздух, пищевые продукты, трупы животных и человека, переносчики) обычно содержит ассоциации микробов.
Выделение чистой культуры позволяет изучить морфологические, культуральные, биохимические, антигенные и другие признаки, по совокупности которых определяется видовая и типовая принадлежность возбудителя, то есть производится его идентификация.
Для выделения чистых культур микроорганизмов используют методы, которые можно разделить на несколько групп.
Метод Пастера – последовательное разведение исследуемого материала в жидкой питательной среде до концентрации одной клетки в объеме (имеет историческое значение).
2. Метод Коха («пластинчатые разводки») – последовательное разведение исследуемого материала в расплавленном агаре (температура 48-500С), с последующим разливом в чашки Петри, где агар застывает.
Высевы делают, как правило, из трех-четырех последних разведений, где бактерий становится мало и, в дальнейшем, при росте на чашках Петри появляются изолированные колонии, образующиеся из одной исходной материнской клетки. Из изолированных колоний в глубине агара получают чистую культуру бактерий пересевом на свежие среды.
Метод Шукевича – применяется для получения чистой культуры протея и других микроорганизмов обладающих «ползущим» ростом. Посев исследуемого материала производят в конденсационную воду у основания скошенного агара. Подвижные микробы (протей) способны подниматься вверх по скошенному агару, неподвижные формы остаются расти внизу на месте посева.
Пересевая верхние края культуры можно получить чистую культуру.
4. Метод Дригальского – широко применяется в бактериологической практике, при этом исследуемый материал разводят в пробирке стерильным физиологическим раствором или бульоном.
Одну каплю материала вносят в первую чашку и стерильным стеклянным шпателем распределяют по поверхности среды. Затем этим же шпателем (не прожигая его в пламени горелки) делают такой же посев во второй и третьей чашках. С каждым посевом бактерий на шпателе остается все меньше и меньше и, при посеве на третью чашку, бактерии будут распределяться по поверхности питательной среды отдельно друг от друга.
Через 1-7 сут выдерживания чашек в термостате (в зависимости от скорости роста микроорганизмов) на третьей чашке каждая бактерия дает клон клеток, образуя изолированную колонию, которую пересевают на скошенный агар с целью накопления чистой культуры.
5. Метод Вейнберга. Особые трудности возникают при выделении чистых культур облигатных анаэробов.
Если контакт с молекулярным кислородом не вызывает сразу же гибели клеток, то посев производят по методу Дригальского, но после этого чашки сразу помещают в анаэростат. Однако чаще пользуются методом разведения. Сущность его заключается в том, что разведения исследуемого материала проводят в расплавленной и охлажденной до 45-500С агаризированной питательной среде. Делают 6-10 последовательных разведений, затем среду в пробирках быстро охлаждают и заливают поверхность слоем смеси парафина и вазелинового масла, чтобы помешать проникновению воздуха в толщу питательной среды.
Иногда питательную среду после посева и перемешивания переносят в стерильные трубки Бурри или капиллярные пипетки Пастера, концы которых запаивают. При удачном разведении в пробирках, трубках Бурри, пипетках Пастера вырастают изолированные колонии анаэробов.
Чтобы изолированные колонии хорошо были видны, используют осветленные питательные среды. Для извлечения изолированных колоний анаэробов, пробирку слегка нагревают, вращая ее над пламенем, при этом агар, прилегающий к стенкам, плавится и содержимое пробирки в виде агарового столбика выскальзывает в стерильную чашку Петри.
Столбик агара разрезают стерильным пинцетом и извлекают колонии петлей. Извлеченные колонии помещают в жидкую среду, благоприятную для развития выделяемых микроорганизмов (например, среду Китта-Тароцци). Агаризированную среду из трубки Бурри выдувают, пропуская газ через ватную пробку.
6. Метод Хангейта – когда хотят получить изолированные колонии бактерий с особенно высокой чувствительностью к кислороду (строгие аэробы) используют метод вращающихся пробирок Хангейта.
Для этого расплавленную агаризированную среду засевают бактериями при постоянном токе через пробирку инертного газа, освобожденного от примеси кислорода. Затем пробирку закрывают резиновой пробкой и помещают горизонтально в зажим, вращающий пробирку, среда при этом равномерно распределяется по стенкам пробирки и застывает тонким слоем. Применение тонкого слоя в пробирке, заполненной газовой смесью, позволяет получить изолированные колонии, хорошо видимые невооруженным глазом.
Выделение отдельных клеток с помощью микроманипулятора . Микроманипулятор – прибор, позволяющий с помощью специальной микропипетки или микропетли извлекать одну клетку из суспензии. Эту операцию контролируют под микроскопом. На предметном столике микроскопа устанавливают влажную камеру, в которую помещают препарат «висячая капля».
В держателях операционных штативов закрепляют микропипетки (микропетли), перемещение которых в поле зрения микроскопа осуществляется с микронной точностью благодаря системе винтов и рычагов.
Исследователь, глядя в микроскоп, извлекает отдельные клетки микропипетками и переносит их в пробирки со стерильной жидкой средой для получения клона клеток.
Предыдущая17181920212223242526272829303132Следующая
ПОСМОТРЕТЬ ЕЩЕ:
Методы выделения чистых культур аэробных бактерий
а) Метод Пастера – имеет историческое значение, предусматривает последовательное разведение исследуемого материала в жидкой питательной среде методом переката
б) Метод Коха – метод пластинчатых разводок – основан на последовательном разведении исследуемого материала мясо-пептонным агаром с последующей разливкой пробирок с разведенным материалом в чашки Петри
в) Метод Дригальского – при посеве материала, обильно обсемененного микрофлорой, используют 2–3 чашки для последовательного посева шпателем.
г) Посев петлей параллельными штрихами .
Биологические методы основаны на биологических свойствах возбудителей.
а) Биологический – заражение высокочувствительных животных, где микробы быстро размножаются и накапливаются.
В одних случаях, этот метод является единственным, позволяющим вы-делить культуру возбудителя от больного человека (например, при туляремии),в других случаях – он более чувствителен (например, выделение пневмококка на белых мышах или воз-будителя туберкулеза на морских свинках).
б) Химический
– основан на кислотоустойчивости микобактерий. Для освобождения материала от сопутствующей флоры, его
обрабатывают раствором кислоты.
Вырастут только туберкулезные палочки, так как кислотоподатливые микробы погибли под действием кислоты.
в) Физический метод
основан на устойчивости спор к нагреванию. Для выделения культуры спорообразующих бактерий из
смеси материал прогревают при 80°С и засевают на питательную среду. Вырастут только споровые бактерии, так как споры их остались живыми и дали рост.
г) Метод Щукевича – основан на высокой подвижности вуль-гарного протея, способного давать ползучий рост.
Методика пересева из колоний на скошенный агар и МПБ:
а) Пересев из колоний на скошенный агар
Приоткрывают крышку чашки, прокаленной остуженной петлей снимают часть отдельной колонии, открывают пробирку со стерильным скошенным агаром, держа ее в левой руке в наклонном положении, так, чтобы можно было наблюдать поверхность среды.
Переносят петлю с культурой в пробирку, не прикасаясь к стенкам, растирают по питательной среде, скользя по поверхности от одного края пробирки к другому, поднимая штрихи до верхушки среды – посев штрихом. Пробирку закрывают и, не выпуская из рук, подписывают название посеянного микроба и дату посева.
б) Пересев из колонии на мясо-пептонный бульон
Техника пересева на МПБ в основном такая же, как и при посеве на плотную среду.
При посеве на МПБ петлю с находящимся на ней материалом погружают в среду. Если материал вязкий и с петли не снимается, его растирают на стенке сосуда, а затем смывают жидкой средой. Жидкий материал, набираемый стерильной пастеровской или градуированной пипеткой, вливают в питательную среду.
В результате самостоятельной работы студент должен знать:
Методы выделения чистой культуры микроорганизмов
2. Методы культивирования микроорганизмов
Уметь:
1. Навыки соблюдения правил противоэпидемического режима и техники безопасности
Обеззараживать материал, проводить обработку рук
3. Приготовить препараты из колоний бактерий
4. Микроскопировать колоний
5. Окрашивать по Граму микроорганизмы
ЗАНЯТИЕ 8
ТЕМА.
Методы выделения чистых культур (продолжение). Ферментативная активность бактерий и методы ее изучения.
К чему снится видеть свои глаза — толкование сна по сонникам
Нумерология имени — расчет и расшифровка онлайн
Гадания для незамужних девушек в рождественский сочельник Рождественские гадания дома на замужество